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<!DOCTYPE html>

<title>Plaque-Assay</title>

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<h1 id="firstHeading" class="firstHeading mw-first-heading"><span class="mw-page-title-main">Plaque-Assay</span></h1>

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</div>

<p>Ein <span lang="en"><b>Plaque-Assay</b></span> (frz. <span lang="fr"><i>plaque</i></span> [plak] für „Platte; Fleck; Schild“; engl. <span lang="en"><i>assay</i></span>, s. <a href="Assay" title="Assay">Assay</a>) ist ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von infektiösen cytopathischen <a href="Viren" title="Viren">Viren</a>, bei dem eine zu untersuchende Probe in unterschiedlichen Verdünnungen in eine <a href="Zellkultur" title="Zellkultur">Zellkultur</a> eingebracht wird.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Prinzip">Prinzip</h2></div>

<p>Aufgrund eines <a href="Cytopathischer_Effekt" title="Cytopathischer Effekt">cytopathischen Effektes</a> kommt es nach <a href="Infektion" title="Infektion">Infektion</a> von Zellen mit Viruspartikeln (synonym <i><a href="Virion" title="Virion">Virionen</a></i>) zur <a href="Lyse_(Biologie)" title="Lyse (Biologie)">Lyse</a> der Zellen und deren unmittelbaren Nachbarzellen. Nach Lyse dieser Zellen gelangen freigesetzte Viruspartikel wiederum in benachbarte Zellen, das Virus breitet sich dadurch immer weiter aus. So kommt es zu einem Fleck in einem zuvor <a href="Konfluenz_(Zellkultur)" title="Konfluenz (Zellkultur)">konfluenten</a> Zellrasen, weil dort die Zellen lysiert wurden. Die Löcher im Zellrasen werden als <i>Lysishof</i> oder <span lang="fr"><i>Plaque</i></span> bezeichnet. Wird ein infizierter Zellrasen nach einer angemessenen Zeit, in der sich solche Plaques bilden konnten, fixiert und anschließend mit <a href="Methylenblau" title="Methylenblau">Methylenblau</a>, <a href="Kristallviolett" title="Kristallviolett">Kristallviolett</a> oder <a href="Neutralrot" title="Neutralrot">Neutralrot</a> gefärbt und gewaschen, so erkennt man die Plaques als leere, nicht gefärbte Stellen, von denen sich die toten, lysierten Zellen beim Waschen teilweise abgelöst haben.<sup id="cite_ref-1" class="reference"><a href="#cite_note-1"><span class="cite-bracket">[</span>1<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Die Plaques werden (zum Teil vollautomatisiert) gezählt und zusammen mit dem bekannten eingesetzten Volumen und dem Verdünnungsfaktor wird die <a href="Konzentration_(Chemie)" title="Konzentration (Chemie)">Konzentration</a> an infektiösen Viruspartikeln in der untersuchten Probe ermittelt, typischerweise als Infektiöse Einheiten je Milliliter, IE/ml, oder <span lang="en"><i>plaque forming units</i></span> je Milliliter, PFU/ml.

</p><p>Im Gegensatz zur Konzentrationsbestimmung von Viren im Blut oder Serum im Sinne einer <a href="Viruslast" title="Viruslast">Viruslast</a> mittels Nachweis der viralen <a href="DNA" class="mw-redirect" title="DNA">DNA</a> oder <a href="RNA" class="mw-redirect" title="RNA">RNA</a> durch <a href="Polymerase-Kettenreaktion" title="Polymerase-Kettenreaktion">PCR</a> und eine evtl. vorangehende <a href="Reverse_Transkription" title="Reverse Transkription">Reverse Transkription</a>, werden beim <span lang="en">Plaque-Assay</span> inaktivierte oder nicht-infektiöse Partikel innerhalb einer Viruspopulation nicht erfasst. Der <span lang="en">Plaque-Assay</span> ist daher ein direktes Maß für die Konzentration infektiöser Partikel in einer Probe. Da jedoch nicht alle auf die Zellen gegebenen infektiösen Virionen auch (nach der Virenzugabe und vor der Polymerzugabe) zu einer Infektion führen, und nicht alle Viruspartikel weit genug voneinander entfernt auf den Zellrasen gelangen, werden im <span lang="en">Plaque-Assay</span> tendenziell zu niedrige Werte ermittelt.

</p><p>Zur Verbesserung der Genauigkeit der Methode können die Zellen nach der Infektion mit einem <a href="Polymer" title="Polymer">Polymer</a> (z. B. <span lang="en"><i>low-melting <a href="Agarose" title="Agarose">Agarose</a></i></span><sup id="cite_ref-2" class="reference"><a href="#cite_note-2"><span class="cite-bracket">[</span>2<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> oder <a href="Zellulose" class="mw-redirect" title="Zellulose">Zellulosepulver</a><sup id="cite_ref-3" class="reference"><a href="#cite_note-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup>) überschichtet werden. Diese Beschichtung verhindert während der drei Tage des Versuchs bei Stößen oder Vibrationen eine ungewollte Infektion von Zellen über das <a href="Kulturmedium" class="mw-redirect" title="Kulturmedium">Kulturmedium</a> und erlaubt nur direkte Infektionen von Nachbarzellen, da sonst möglicherweise über das Medium Plaques von Tochtervirionen der folgenden Generationen entstehen können und eine zu hohe Konzentration ermittelt würde. Da <i>low-melting-Agarose</i> auf etwa 50 °C erhitzt werden muss, besteht im Vergleich bei Zellulosepulver kein Risiko, dass die Zellen erhitzt werden.

</p><p>Bei Viren, die keinen cytopathischen Effekt aufweisen, kann die Viruskonzentration über die <span lang="en"><i>tissue culture infectious dose of 50 %</i></span> (TCID<sub>50</sub>, synonym <i>cell culture infectious dose</i>, CCID<sub>50</sub>) bestimmt werden.<sup id="cite_ref-4" class="reference"><a href="#cite_note-4"><span class="cite-bracket">[</span>4<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Diese Methode basiert auf der Infektion der Zellkultur und einem beliebigen Nachweis (z. B. <a href="Indirect_immunoperoxidase_assay" class="mw-redirect" title="Indirect immunoperoxidase assay">Indirect immunoperoxidase assay</a>, <a href="Immunfluoreszenztest" class="mw-redirect" title="Immunfluoreszenztest">Immunfluoreszenztest</a>, <a href="DNA-Extraktion" title="DNA-Extraktion">DNA-Extraktion</a> mit <a href="Polymerase-Kettenreaktion" title="Polymerase-Kettenreaktion">PCR</a>, <a href="RNA-Extraktion" title="RNA-Extraktion">RNA-Extraktion</a> mit <a href="RT-PCR" class="mw-redirect" title="RT-PCR">RT-PCR</a>), ob eine Zellkultur nach einem längeren Zeitraum (z. B. sieben Tage) überhaupt infiziert ist. Die Bestimmung der TCID<sub>50</sub> umgeht das Problem der Infektion durch Tochtervirionen durch die Vermeidung einer Zählung von Plaques, da nur die <a href="Grenzverd%C3%BCnnung" class="mw-redirect" title="Grenzverdünnung">Grenzverdünnungen</a> ermittelt werden, bei der noch eine Infektion stattfindet.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Anwendungen">Anwendungen</h2></div>

<p>Mit dem <span lang="en">Plaque-Assay</span> können nur Viruspartikel-Konzentration von Viren nachgewiesen werden, die eine verwendete <a href="Zelllinie" title="Zelllinie">Zelllinie</a> infizieren können, darin replizieren und auch zur Lyse der Zellen führen wie z. B. <a href="Influenzavirus" class="mw-redirect" title="Influenzavirus">Influenzaviren</a> in <a href="MDCK-Zelle" class="mw-redirect" title="MDCK-Zelle">MDCK-Zellen</a>.<sup id="cite_ref-5" class="reference"><a href="#cite_note-5"><span class="cite-bracket">[</span>5<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Der <span lang="en">Plaque-Assay</span> kann bei <a href="Lytischer_Zyklus" title="Lytischer Zyklus">lytischen Viren</a> auch zur Bestimmung der <a href="Viruslast" title="Viruslast">Viruslast</a>, eines <a href="Virustiter" class="mw-redirect" title="Virustiter">Virustiters</a> oder der <a href="Minimale_Infektionsdosis" class="mw-redirect" title="Minimale Infektionsdosis">minimalen Infektionsdosis</a> verwendet werden.

</p><p>Der <span lang="en">Plaque-Assay</span> kann neben der Bestimmung der Konzentration infektiöser Virionen auch in einem <a href="Neutralisationstest" title="Neutralisationstest"><i>Virus-Neutralisations-Assay</i></a> (synonym Plaque-Reduktions-Assay) zum Nachweis <a href="Neutralisierende_Antik%C3%B6rper" class="mw-redirect" title="Neutralisierende Antikörper">infektionshemmender Antikörper</a> gegen Teile des <a href="Virion" title="Virion">Virions</a> dienen. Dafür werden Viren in bekannter Konzentration mit einer auf neutralisierende Antikörper zu testenden Probe vorher inkubiert und anschließend auf die Zellen gegeben. Binden die Antikörper an jene Oberflächen<a href="Epitope" class="mw-redirect" title="Epitope">epitope</a> der Viren, die zur Aufnahme in die Zelle notwendig sind, so sieht man im <span lang="en">Plaque-Assay</span> eine Verringerung der PFU/mL im Vergleich zu einer <a href="Negativkontrolle" class="mw-redirect" title="Negativkontrolle">Negativkontrolle</a> ohne diese Antikörper.<sup id="cite_ref-6" class="reference"><a href="#cite_note-6"><span class="cite-bracket">[</span>6<span class="cite-bracket">]</span></a></sup>

</p><p>Der Plaque-Assay wird auch genutzt, um die Wirkung von Desinfektionsmitteln zu untersuchen, bei denen das virale <a href="Genom" title="Genom">Genom</a> nicht beeinträchtigt wird und unverändert nachweisbar bleibt, hingegen die Infektiosität der <a href="Virion" title="Virion">Virionen</a> reduziert wird. Mit dem <span lang="en">Plaque-Assay</span> kann auch untersucht werden, wie hoch die Konzentration von infektiösen Viren in einer gesammelten Probe oder nach einer Virusanzucht im Zellkulturmedium ist. Bei vielen Viren (insbesondere <a href="RNA-Virus" title="RNA-Virus">RNA-Viren</a>) ist nur ein geringer Prozentsatz der freigesetzten Virionen auch tatsächlich infektiös.

</p><p>Der Vorläufer des <span lang="en">Plaque-Assays</span> erfasste bei <a href="Influenzavirus" class="mw-redirect" title="Influenzavirus">Influenzaviren</a> anhand der Veränderung des <a href="Amnion" title="Amnion">Amnions</a> infizierter <a href="Embryoniertes_H%C3%BChnerei" title="Embryoniertes Hühnerei">embryonierter Hühnereier</a> die Anzahl <span lang="en"><i>focus forming units</i></span> pro Milliliter.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Literatur">Literatur</h2></div>

<ul><li>H. L. Bachrach, J. J. Callis et al.: <i>A plaque assay for foot-and-mouth disease virus and kinetics of virus reproduction</i>. Virology (1957) 4(2): S. 224–36 <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13496542?dopt=Abstract">PMID 13496542</a></li>

<li>P. D. Cooper: <i>The plaque assay of animal viruses</i>. Adv Virus Res (1961) 8: S. 319–78 <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13881155?dopt=Abstract">PMID 13881155</a></li></ul>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Einzelnachweise">Einzelnachweise</h2></div>

<li id="cite_note-1"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-1">↑</a></span> <span class="reference-text">M. B. Gonzalez-Hernandez, J. Bragazzi Cunha, C. E. Wobus: <i>Plaque assay for murine norovirus.</i> In: <i>Journal of visualized experiments : JoVE.</i> Nummer 66, 2012, S. e4297, <span class="-print"><a href="Internationale_Standardnummer_f%C3%BCr_fortlaufende_Sammelwerke" title="Internationale Standardnummer für fortlaufende Sammelwerke">ISSN</a> <span style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://zdb-katalog.de/list.xhtml?t=iss%3D%221940-087X%22&key=cql">1940-087X</a></span></span>. <a href="Digital_Object_Identifier" title="Digital Object Identifier">doi</a>:<span class="uri-handle" style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://doi.org/10.3791/4297">10.3791/4297</a></span>. <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22951568?dopt=Abstract">PMID 22951568</a>. <a rel="nofollow" class="external text" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3487293/">PMC 3487293</a> (freier Volltext).</span>

</li>

<li id="cite_note-2"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-2">↑</a></span> <span class="reference-text">C. R. Gaush, T. F. Smith: Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. <i>Appl Microbiol.</i> 16(4):588-94 (1968). <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5647517?dopt=Abstract">PMID 5647517</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-3"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-3">↑</a></span> <span class="reference-text">M. Matrosovich, T. Matrosovich, W. Garten, H. D. Klenk: New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. <i>Virol J.</i> 3:63 (2006). <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16945126?dopt=Abstract">PMID 16945126</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-4"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-4">↑</a></span> <span class="reference-text">Y. Gao, I. Nankya, A. Abraha, R. M. Troyer, K. N. Nelson, A. Rubio, E. J. Arts: Calculating HIV-1 Infectious Titre Using a Virtual TCID50 Method. <i>Methods in Molecular Biology</i> Vol. 485 Page 27-35 (2008). <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19020816?dopt=Abstract">PMID 19020816</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-5"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-5">↑</a></span> <span class="reference-text">A. J. Eisfeld, G. Neumann, Y. Kawaoka: <i>Influenza A virus isolation, culture and identification.</i> In: <i>Nature protocols.</i> Band 9, Nummer 11, November 2014, S. 2663–2681, <a href="Digital_Object_Identifier" title="Digital Object Identifier">doi</a>:<span class="uri-handle" style="white-space:nowrap"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://doi.org/10.1038/nprot.2014.180">10.1038/nprot.2014.180</a></span>, <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25321410?dopt=Abstract">PMID 25321410</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-6"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-6">↑</a></span> <span class="reference-text">M. de Graaf, S. Herfst, E. J. Schrauwen et al.: An improved plaque reduction virus neutralization assay for human metapneumovirus. <i>J Virol Methods</i> 143(2): S. 169–74 (2007). <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17420056?dopt=Abstract">PMID 17420056</a>.</span>

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